内参基因：为什么相对定量必须使用内参

        荧光定量PCR的主要用途之一是相对定量，而提到相对定量，必然离不开内参，那什么是内参基因？为什么相对定量必须使用内参？如何选择正确的内参基因？今天，我们就来聊聊关于内参的那些事。

什么是内参？

内参基因，也称为管家基因，其编码蛋白是维持细胞基本生命活动所必须的蛋白质。它的表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。管家基因高度保守且在大多数情况下持续表达，稳定表达于不同类型的细胞和组织中。

为什么相对定量必须使用内参？

那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢？我们通过以下实验案例一起了解一下。

实验目的测定肝癌细胞X基因相对于正常肝细胞的表达量。通过荧光定量检测可得肝癌细胞中X基因的CT=25，正常肝细胞中X基因的CT=26，所以，利用表达量倍数计算公式2-△CT计算，发现肝癌细胞中的X基因表达量是正常肝细胞表达量的2倍。

，上面这个定量结果检测有效的前提是必须保证两盘细胞的细胞数量完全一致；RNA提取、逆转录以及定量效率及操作必须完全一致；不存在操作误差等。这显然是无法达到的。

那如何才能使这些误差不影响X基因表达检测的真实性呢？

这时，为了将样本处理归一化，引入一个内参进行校正。基于前面对内参基因特点的描述，我们知道内参基因在两类细胞（正常肝细胞/肝癌细胞）中的表达量是相对一致的，所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后X基因的表达量。

肝癌细胞X基因CT=25，内参基因CT=20；正常肝细胞X基因CT=26，内参基因CT=22。所以，内参校正后，肝癌细胞中的X基因表达量是正常肝细胞表达量的1/2倍（计算公式2-△△CT）。

由此可见，若想有效检测一个特定基因的相对表达情况，选择内参进行归一化处理非常重要！

如何选择合适的内参？

理想状态下的内参应在各种实验条件下，各种类型的组织和细胞中恒定表达，且表达量稳定。那是否在实验中只要选择一个常见的内参就可以了呢？

我们来看下面这个案例

这份资料中描述了不同内参基因在不同的组织中的表达情况。以B2M内参基因为例，其在胎儿大脑与白细胞中的表达量相差数百倍。若使用B2M对胎儿大脑与白细胞中某一基因的表达量进行校准，得到结果显然是不可信的。

那如何来选择合适的内参呢？

，是内参的获得。常见内参获取的途径有如下三个

✦途径一通过查询相关文献，获取内参。

✦途径二选择常用的多个内参进行实验验证。较常见内参基因见下图表

✦途径三通过查询ICG库，获取内参

网站中搜集了文献报道的常见细胞/组织适用的内参。

如ICG库中收录的肺癌常见细胞系对应的内参基因有ACTB、PPIA、PGK1。

，是内参的验证。选定的内参是否满足你的实验，是否在你的不同实验组中是稳定表达的呢？

我们先一起来了解下面这个案例

该实验主要目的 NIH3T3细胞系在无血清培养基中培养24h后，添加15%血清，观察8h内特定基因的表达量。本实验选取了两个内参基因GAPDH与β-2-microglobulin进行实验验证。在不同实验组下，通过利用2-△CT（△CT=CT,Time x - CT,Time 0）计算得到9个数据，通过进行统计学分析，判定这9个数据差异是否显著。实验结果表明，GAPDH p＜0.0001，差异极显著，β-2-microglobulin p=0.2345，差异不显著。说明GAPDH在该实验模型中表达不稳定，不建议将GAPDH作为该实验的内参。

通过这个案例可以知道，验证内参时，其一、尽可能选用多个内参进行实验；其二、通过在不同样本处理上的表达差异检测情况，来选择合适的内参。

        ，在相对定量检测中，最重要的是选择合适的内参基因；而选择合适的内参基因中，最重要的，则是实验内参基因在不同处理间的表达稳定性。选择合适的内参，是相对定量成功的开端！